Contrairement au JAG (dans laquelle les protagonistes se chargent de mener l'enquête et de plaider lors des procès), l'équipe de NCIS mène l'enquête en alternant interrogatoires et recherches scientifiques. L'équipe est composée de l'agent Leroy Jethro Gibbs qui gère une équipe formée de deux scientifiques et deux autres enquêteurs. Cette nouvelle équipe est chargée de mener l'enquête et de passer les indices au peigne fin, lorsque la marine est impliquée dans une affaire de meurtre ou un décès suspect.
Au-delà du fait divers, NCIS : Enquêtes Spéciales fait une place plus importante aux jeux de pouvoir que se livrent les différents services ou organismes militaires et gouvernementaux dans la lutte contre le terrorisme.

Agent Leroy Jethro Gibbs (Mark Harmon)
Ancien sergent des marines, il est le leader charismatique de l'équipe NCIS. Il s'amuse beaucoup à donner des leçons d'enquêteur à ses propres agents.
Signes distinctifs : il a plus de 37 ans, il est fils unique, il parle chinois, il est accro à la caféine, a la vue qui commence à faiblir, a dit que les femmes avec qui il est sorti trouvaient l'odeur de sciure de bois sexy, il a été marié 3 fois, il est sensible aux charmes des rouses, son ex-femme n°2 l'a frappé à la tête avec une batte de baseball, son ex-femme n°3 l'a attaqué avec un club de golf,  a eu une blessure au bras droit dûe à un shrapnel lors d'une mission en Colombie et son numéro de téléphone : 708 555 3212 (ce numéro de téléphone sert pour la série, vous n'aurez pas Mark Harmon/Gibbs au bout du fil, inutile d'essayer de l'appeler !).  

Agent Kate Todd [Saisons 1-2] (Sasha Alexander)
Anciennement des services secrets, Caitlin est embauché par Gibbs pour rejoindre le NCIS. C'est une experte en profilage, spécialiste de la garde rapprochée et aime dessiner les membres de son équipe.Tenace et pleine de ressources, elle découvre au fil des enquêtes les codes de conduite de la Marine parfois trés particuliers pour un civil.
Signes distinctifs : elle a une sœur, elle possède un tatouage qui ne serait ni une rose ni un papillon et qu'elle se serait fait faire alors qu'elle avait trop bu, elle aimerait vivre dans une petite ville, elle fait apparemment très attention à ce qu'elle mange (alimentation bio), elle aime la cuisine chinoise et elle dort toujours avec une arme chargée sous son oreiller, a été fiancée une fois, ne s'est jamais mariée. 

Agent Anthony Dinozzo (Michaël Weatherly)
Ancien détective spécialisé dans les meurtres, "Tony" est le personnage le plus en roue libre. Un brin impertinent et rebelle, avec une tendance macho, son mode de travail est essentiellement dans l'action et dans la pêche aux infos, notamment par la drague. Il faut dire que son passé à la Brigade criminelle de Baltimore l'a habitué à travailler dans la rue.
Signes distinctifs : c’est un cinéphile averti et il n'hésite pas à étaler ses connaissances en cinéma lors de diverses enquêtes, il possède une Ford Mustang de 1966, il aime offrir aux femmes du talc parfumé, enfant, son père l'obligeait à participer à des reconstitutions de la Guerre de Secession où il faisait office de "Little Poo Boy" (il devait ramasser les dejections des chevaux) et  sa mère lui faisait prendre des cours de piano et il était selon lui très doué. 

Docteur Donald Mallard ("Ducky") (David McCallum)
Voici le médecin légiste de la NCIS assigné à l'équipe. C'est un grand agité, un grand bavard, et un esprit inquisiteur qui ne peut laisser aucune énigme irrésolue.
Signes distinctifs : Comme son travail l'oblige à traiter constamment avec la mort, il a développé une intuition aigue, même si son sens de l'humour est quelque peu sombre, il vit avec sa mère âgée, il a fait ses études au Royaume-Uni, il possède une ancienne voiture anglaise (qui se conduit donc à droite) et parle toujours aux cadavres qu’il doit examiner. 

 Agent Abby Sciuto (Pauley Perrette)
La jeune experte médico-légale, le petit génie à l'affût de la moindre trace qui effectue inlassablement sa mission enfermée dans un laboratoire. Ce qu'elle préfère après son boulot: le look gothique et les tatouages... 
Elle a apprit les prémisses de son métier dans une décharge pour voiture accidentée près de laquelle elle vivait quand elle était enfant...
Autres particularités: ses parents étant sourds-muets et elle parle le langage des signes, elle a un frère plus jeune qu'elle, elle dort dans un cercueil, elle parle de temps en temps le langage des sourds avec Gibbs,
elle a un hippopotame péteur appelé "Bert"et elle écoute du «Android lust».
Et, pour l'anecdote, Pauley Perrette a effectivement étudié la science criminelle à l'université...  

Timothy McGee (Sean Murray) [Dés la saison 2, récurrent avant]
Timothy est le petit nouveau de l'équipe. Il débarque de Norfolk et devient agent de terrain à plein temps dans l'équipe de Gibbs. Il est très intelligent, sa spécialité étant l'informatique (il est diplômé de Massachusetts Institute of Technology),lui et Abby forment une parfaite équipe.
Signes particuliers : il a un caractère un peu naïf et gaffeur, il subit les foudres de Gibbs et les moqueries de ces collègues qui le surnomment le « bleu », il a une soeur plus jeune que lui nommé Sarah, il écrit un roman intitulé "Deep Six, the continuing adventures of L.J Tibbs", il a une relation amour/amitié avec Abby, il fait partie d'un club de romancier, et joue en reseau en incarnant un seigneur des elfes. 

Ziva David (Cote De Pablo) [Dés la saison 3]
Détachée du MOSSAD, cette jeune agent israélienne est une experte en bombe, en terrorisme mais aussi en arts martiaux. Elle intègre officiellement l'équipe dans l'épisode 3.4 et succède ainsi à Kate.
Signes particuliers : elle est une pro de l'interrogatoire tout comme Gibbs, est une vraie calamité lorsqu'elle conduit, elle ronfle quand elle dort, elle fait très bien la cuisine et invite des membres de l'équipe à goûter ses plats, elle est rentrée au Mossad avant que sa soeur soit tuée lors d'une attaque terroriste par une "bombe humaine", elle parle 5 langues, elle possède un piano, elle a des brûlures sur les jambes mais ne veux pas dire comment elle les a eu,  un ami à elle infiltré dans le Hezbollah s'est fait prendre et on lui a tranché la tête, donc depuis lors, Ziva s'est juré qu'elle ne se ferait jamais capturer vivante, elle a déjà "couché" afin d'obtenir des informations, et elle as du mal avec l’anglais (confond des mots et des expressions).